青钱柳提取物安全性毒理学试验研究

2024-01-19 来源：福建农村网

摘要：【目的】观察青钱柳提取物安全毒理性，为其安全应用提供参考。【方法】24 h内对小鼠灌胃2次，剂量为18 g/kg·bw的青钱柳提取物，进行急性毒性试验，连续观察14天。进行三项遗传毒性试验：Ames试验、小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验和小鼠精子畸形试验；30天喂养毒性试验，将大鼠随机分为正常对照组和青钱柳提取物高、中、低剂量组（2.00、1.20和0.60 g/kg），连续灌胃30天。【结果】青钱柳提取物对小鼠的最大耐受剂量（MTD）大于18 g/kg·bw。三项遗传毒性试验的结果都是阴性。30天喂养试验，与正常对照组比较，青钱柳提取物高、中、低3个剂量组动物行为活动、进食量等均未见异常；血液学指标、血液生化指标、脏器/体重比值及病理组织学检查未发现与青钱柳提取物相关的异常改变。【结论】在本实验条件下，未观察到青钱柳提取物有明显毒性反应。

关键词：青钱柳叶；青钱柳提取物；毒理；安全性 

青钱柳（Cyclocarya paliurus（Batal.）Iljin-skaja）属胡桃科青钱柳属乔木植物，主要分布在湖南、江西、广东、贵州等省份，一般生长在海拔400 m~2500 m的石灰岩山区等地^[1]。青钱柳是中国特有的单种属植物，也是国家重点保护的濒危植物之一。它被称为“植物界的大熊猫”和“医学界的第三棵树”^[2]。《本草纲目》记载：“青钱柳叶有健脾化湿、清热通腑、疏肝理气、滋阴补肾的作用”。现代研究证明，青钱柳具有抗氧化^[3-4]、降血糖^[5-6]、降血脂^[7-8]、降血压^[9]、提高免疫力^[10]和保护肝脏^[11]等药理作用。青钱柳叶中含有很多种活性成分，包括多糖类、黄酮类、三萜类等化学成分，其中青钱柳多糖^[12-13]是人们关注的焦点。李磊等^[14-15]研究发现，青钱柳叶富含人们身体必需的一些常量元素和一些微量元素，这些元素在预防疾病和治疗疾病中起着重要作用。

目前，青钱柳叶的成分及药理作用已有相关研究，但其安全性毒理学试验研究还未有人涉足。因此，本试验采用急性毒性试验、遗传毒性试验、大鼠30 d喂养试验等安全毒理学评价方法，确定青钱柳提取物的无毒剂量以及安全范围，为人用剂量安全范围提供依据。探讨青钱柳提取物的毒理学作用，为青钱柳提取物产品在功能性食品和保健食品等领域的开发及利用提供了食用安全依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 受试物:青钱柳提取物，实验室自制。青钱柳提取物批号20211003B。 

1.1.2 浸提工艺:干燥的青钱柳叶加12倍量水，90 ℃浸泡2次，每次2 h，过滤，滤液浓缩、低温真空干燥，得青钱柳提取物干粉，青钱柳提取率为10.02 %。

1.1.3 试验动物:昆明种小鼠、Wistar大鼠。均由福建医科大学提供。对昆明种小鼠进行了急性毒性试验和三项遗传毒性试验；对Wistar大鼠进行30天喂养生理生化试验。

1.2 小鼠急性毒性试验

选择健康的小鼠共20只，雄雌各一半，体重为20.0～22.0 g。首次试验前将小鼠禁食16个小时、不禁水。小鼠每只称重，采用最大耐受剂量（MTD）法，对小鼠灌胃染毒，24小时内灌胃两次，间隔6小时，剂量为18 g/kg·bw。给药试验物质后，连续14天观察小鼠的体重增减变化、一般生活状态和行为活动、中毒表现和死亡数量等。试验结束时，对小鼠进行体重称量。试验结束后，将所有小鼠处死并解剖，肉眼观察小鼠大体病理变化。求出小鼠对受试物质的最大耐受剂量，以此来判断青钱柳提取物的急性毒性。

1.3 小鼠遗传毒性试验 

1.3.1 Ames试验

对鼠伤寒沙门菌突变型菌株TA97、TA98、TA100和TA102进行了鉴定，并确定其符合要求。采用平板掺入法，加入和不加入S9混合液的回复诱变试验，试验设置5000，l000，200，40，8 μg/皿5个剂量组。+S9试验的阳性对照为2-氨基芴（10 μg/皿，适用于TA97、TA98和TA100菌株）、1，8-二羟基蒽醌（50 μg/皿，适用于TA102菌株）；-S9试验的阳性对照为2,4,7-三硝基芴铜（0.2 μg/皿，适用于TA97和TA98菌株）、甲基磺酸甲酯（1.0 μL/皿，适用于TA100和TA102菌株）。同时，设置两个阴性对照组：未处理对照组和溶剂对照组。温度设置37 ℃，恒温培养48小时，并计数每个培养皿中回变菌落数的数量。如果青钱柳提取物五个剂量组中回变菌落数的数量是阴性对照组的两倍以上，且结果显示剂量-反应关系，则可以判断试验结果为阳性。等同条件，做一次重复试验。

1.3.2 小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验 

选择50只健康小鼠，随机分为5个试验小组，每组10只，一半雄性，一半雌性，体重为20～22 g。小鼠分别在第0和24 h进行经口灌胃，三个试验组——受试物剂量分别为2.00、1.20和0.60 g/kg；一个阴性对照组灌胃去离子水；一个阳性对照组为40 mg/kg环磷酰胺。第二次给药试验物质后6小时处死小鼠，并常规制片。在对每只小鼠进行显微镜检查期间，观察和计数一千个嗜多染红细胞，记录含有微核的细胞数量，并计算试验的微核发生率（‰）。

1.3.3 小鼠精子畸形试验

选择25只健康的雄性小鼠，体重为25～30 g，将它们随机分为5个试验组，每组5只小鼠。试验设置三个受试物质剂量组，剂量分别为2.00、1.20和0.60 g/kg；一个阴性对照组灌胃去离子水；一个阳性对照组为40 mg/kg环磷酰胺。连续五天，每天给小鼠灌胃，给予受试物质。第一次灌胃后的第35天将小鼠常规处死，并常规制片。在每只小鼠的显微镜检查中，观察并计数一千个结构完整的精子，记录精子异变畸形的数量，计算精子畸形发生率(%)。

1.4 30天大鼠喂养试验

1.4.1 试验动物及给药方法

选用80只70~80g的健康、断乳Wistar大鼠，将它们随机分为4个小组，每个小组有20只，雌雄各一半。试验设置三个受试物质剂量组，青钱柳提取物的剂量分别为 0.60、1.20和2.00 g/kg。同时，设置一个阴性对照组给大鼠灌胃去离子水。单笼进行喂养，自由饮食，连续观察30天。

1.4.2 大鼠试验观察和指标测定

试验过程中，观察并记录大鼠的外观和行为，并观察和监测体重增加、体温变化、摄食量、饮水量等指标。试验进行30天后，对大鼠红细胞计数、血红蛋白水平、白细胞总数及其分类等血液学指标进行检测及分析。对大鼠检测及分析血液生化指标如尿素氮、谷丙转氨酶、胆固醇等。同时，解剖大鼠，观察其器官是否有明显的病理变化。称重肝脏、肾脏、脾脏和睾丸（卵巢），计算脏体比，并对脾脏、胃、肝脏、肾脏和十二指肠和睾丸（卵巢）进行组织病理学检查。

2 结果

2.1 小鼠急性毒性测定结果

灌胃给予小鼠受试物质后，它的进食、活动和行为都正常，生长和发育良好，没有发现明显的中毒症状，14天内小鼠无死亡情况，结果见表1。试验结束后，对所有小鼠进行解剖，其内脏器官没有发现明显异常。因此认为，青钱柳提取物对小鼠经口MTD均大于18 g/kg·bw。根据急性毒性分级标准，青钱柳提取物属于无毒级。

表1 青钱柳提取物对小鼠急性经口毒性的影响(±s)

2.2 小鼠遗传毒性测定结果

2.2.1 Ames试验

鼠伤寒沙门菌突变型菌株TA97、TA98、TA100 和 TA102 对青钱柳提取物进行5个剂量的试验，在+ S9或-S9的条件下，试验剂量组所检测的回变菌落数都少于未处理对照组和溶剂对照组回变菌落数的两倍，且无剂量-反应关系，表明青钱柳提取物对4种试验菌株没有明显的致基因突变作用，青钱柳提取物Ames实验结果为阴性，结果见表2、表3。

表2 青钱柳提取物Ames试验回变菌落数(±s)（第一次）

注：**超过阴性对照组菌落数2倍以上

表3 青钱柳提取物Ames试验回变菌落数(±s)（第二次）

注：** 超过阴性对照组菌落数2倍以上

2.2.2 小鼠骨髓嗜多染红细胞微核测定结果  

测定小鼠骨髓嗜多染红细胞的微核，雌雄各受试物质剂量组的微核发生率与阴性对照组相比较，都没有显著性差异（P＞0.05），而阳性对照组（环磷酰胺）的微核发生率明显高于阴性对照组，有极显著差异（P＜0.01），显示环磷酰胺具有强烈的致突变作用。结果见表4。未见小鼠骨髓嗜多染红细胞微核发生率与青钱柳提取物有直接的影响。因此，试验结果为阴性。

表4  青钱柳提取物对小鼠骨髓嗜多染红细胞微核发生率的影响

注：** 与阴性对照组比较，p<0.01

2.2.3 小鼠精子畸形试验结果  

由表5可知，空白对照组的精子畸形发生率为1.8 %。阳性对照组（环磷酰胺）的精子畸形发生率为7.4 %，明显对雄性小鼠的生殖细胞具有毒性作用，与空白对照组对比，具有显著性差异（P＜0.01）。三个剂量组的精子畸形发生率分别为2.0 %、2.2 %、2.0 %，精子畸形率都处在正常范围内（正常畸变率为0.8 %～3.4 %），与空白对照组对比，无显著性差异（P＞0.05）。结果表明，青钱柳提取物对小鼠精子畸形的发生率没有直接影响，试验结果为阴性。

表5  青钱柳提取物对小鼠精子畸形率的影响(±s)

注：** 与阴性对照组比较，p<0.01

2.3 30天大鼠喂养试验结果

2.3.1 青钱柳提取物对大鼠体重增长、进食量、食物利用率的影响

在试验期间，大鼠的毛色光亮正常，未见行为异常，未发生死亡。青钱柳提取物低、中、高各剂量组的大鼠都生长发育良好，其体重增重、进食量和食物利用率与空白对照组相比较，均无显著性差异（P＞0.05）。

表6  青钱柳提取物对大鼠总食物利用率的影响（±s）

2.3.2 青钱柳提取物对大鼠血液学指标的影响

试验结束后对大鼠进行常规的血液学指标测定（红细胞总数、血红蛋白、白细胞总数），结果见表7。青钱柳提取物各剂量组雌性和雄性大鼠的血液学指标与空白对照组相比，差异均无统计学意义（P＞0.05）。

表7  青钱柳提取物对大鼠血液学指标的影响（±s）

2.3.3 青钱柳提取物对大鼠血液生化学指标的影响

经口给予大鼠各剂量的青钱柳提取物30 d，测定各剂量组大鼠血液生化学指标（如谷丙转氨酶、谷草转氨酶、总蛋白等）。各剂量组与空白对照组的血液生化指标相比，差异均无统计学意义（P＞0.05）。空白对照组和各剂量组雌、雄大鼠的血液生化指标均在正常范围内，且无明显异常变化。

表8  青钱柳提取物对大鼠血液生化学指标的影响（±s）

2.3.4 青钱柳提取物对大鼠脏体比的影响

青钱柳提取物低、中、高各剂量组雌、雄大鼠的肝/体、脾/体、肾/体、睾丸或卵巢/体与空白对照组相比，差异没有统计学意义（P＞0.05）。

表9  青钱柳提取物对大鼠脏体比的影响（±s）

2.3.5 组织病理学检查

各剂量组大鼠大体解剖检查都没有发现异常。镜检观察雌、雄各剂量组和空白对照组大鼠的肝、肾、脾、性器官等脏器，都没有发现有意义的病理学异常变化。

3 讨论

中国食品工业在开发新资源食品和新食品原料方面取得了显著进展。越来越多的中草药（如保健食品）可直接用于食品添加，也越来越多间接与食品接触的中药提取物（如功效食品）^[16]。青钱柳在2013年被批准为食品原料。青钱柳在中国的应用已经有500多年的历史了，具有很多非常实用的药理作用^[17]，但是青钱柳的安全性问题还未有人涉足。为研究青钱柳提取物的安全性作用，也为了后期开发青钱柳提取物相关的保健食品，本试验中的检验方法是按《食品安全性毒理学评价程序》（2003年版）的要求来进行试验研究的。

急性毒性试验为安全毒理学评价中最基础的一个试验，研究的主要内容是试验动物在24小时内服用一次或多次受试物质后是否有毒性反应和死亡。试验的目的是为了求出试验物质对试验动物的半致死剂量（LD₅₀）。本研究采用最大耐受剂量法进行小鼠急性毒性试验。从试验结果可以看出，青钱柳提取物对小鼠的最大耐受剂量大于18g/kg·bw，青钱柳提取物属无毒级。

遗传毒性试验之间的差异在于其对遗传物质影响的不同终点。Ames试验是检测受试物质是否具有从原核细胞水平诱导基因突变的能力的通用方法。这是一种快速检测化学物质致突变性和潜在致癌性的通用方法。本试验青钱柳提取物对鼠伤寒沙门菌突变型菌株TA97、TA98、TA100和TA102四种试验菌株，均无致突变作用。骨髓嗜多染红细胞微核试验主要是观察受试物质是否改变了试验动物染色体结构的完整性。本试验研究表明，青钱柳提取物低、中、高三个剂量组的微核发生率与阴性对照组相比，均无显著性差异；与阳性对照组（环磷酰胺）比较，具有显著性差异。因此，没有发现青钱柳提取物直接影响小鼠骨髓嗜多染红细胞微核发生率。精子畸形试验主要是给予受试物质一段时间后，观察小鼠精子形态是否发生变化，从而研究受试物质对人类或动物的精子细胞是否具有毒副作用。本试验小鼠精子畸形试验中，青钱柳提取物低、中、高三个剂量组与阴性对照组相比，都没有显著性差异；与阳性对照组（环磷酰胺）相比，具有显著性差异。因此，表明在受试物质的剂量范围内，其对小鼠精子的产生和发育没有影响。

在慢性毒性预试阶段，本试验研究采用30 d喂养试验。在本试验的条件下，对大鼠灌胃青钱柳提取物低、中、高三个试验剂量组，30 d后将试验动物的生长发育情况、血液学指标、血液生化学指标、脏器重量和脏体比值与空白对照组相比，差异均无统计学意义（P＞0.05）。组织病理学检查大鼠的肝、肾、脾、性器官等脏器，都没有发现有意义的病理学异常变化。综上所述，青钱柳提取物在本试验的剂量范围内，未发现其具有明显毒性、遗传毒性作用和慢性毒性作用。因此，说明青钱柳提取物作用于试验动物身上，其具有一定的安全性，值得进一步的研究开发及利用。本试验研究为青钱柳提取物开发成为功能性食品原料，提供安全性毒理学试验的依据。

《海峡农业》2023年第10期 厦门塔斯曼生物工程有限公司 陈剑成，李欣，黄瑞文，周嘉良，陈红，卢绍基